三聚氰胺（英文：Melamine）（化學(xué)式：C3H6N6），俗稱密胺、蛋白精，IUPAC命名為“1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺”，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，被用作化工原料。它是白色單斜晶體，幾乎無(wú)味，微溶于水（3.1g/L常溫），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等，不溶于丙酮、醚類、對(duì)身體有害，不可用于食品加工或食品添加物。
一、原理
試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，經(jīng)陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化后，用液相色譜測(cè)定，外標(biāo)法定量。
二、試劑與材料
除非另有說(shuō)明，所有試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。
a) 甲醇：色譜純；
b) 乙腈：色譜純；
c) 氨水：含量為25％～28％
d) 三氯乙酸；
e) 檸檬酸；
f) 辛烷磺酸鈉：色譜純；
g) 甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取50mL甲醇和50mL水，混勻后備用；
h) 三氯乙酸溶液（1％）：準(zhǔn)確稱取10g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后備用；
i) 氨化甲醇溶液（5％）：準(zhǔn)確量取5mL氨水和95mL甲醇，混勻后備用；
j) 離子對(duì)試劑緩沖液：準(zhǔn)確稱取2.10g檸檬酸和2.16g辛烷磺酸鈉，加入約980
mL水溶解，調(diào)節(jié)pH至3.0后，定容至1L備用；
k) 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：CAS108-78-01，純度大于99.0%；
l) 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取100mg（到0.1mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中，用甲醇水溶液（3.2.7）溶解并定容至刻度，配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃避光保存；
m) 陽(yáng)離子交換固相萃取柱：混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱，基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60mg，3mL，或相當(dāng)者。使用前依次用3mL
n) 甲醇、5mL水活化；
o) 定性濾紙；
p)海砂：化學(xué)純，粒度0.65mm～0.85mm，二氧化硅（SiO2）含量為99%；
q) 微孔濾膜：0.2µm，有機(jī)相；
r) 氮?dú)猓杭兌却笥诘扔?9.999％；
三、儀器和設(shè)備
液相色譜儀：配有紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器；
分析天平：感量為0.0001g和0.01g；
離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于4000r/min；
超聲波水浴；
固相萃取裝置；
氮?dú)獯蹈蓛x；
渦旋混合器；
具塞塑料離心管：50mL；
研缽；
四、樣品處理
1.提取液態(tài)奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等：
稱取2g（至0.01g）試樣于50mL具塞塑料離心管中，加入15mL三氯乙酸溶液和5mL超聲提取10min，再振蕩提取
10min后，以不低于4000r/min離心10min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤(rùn)濕的濾紙過(guò)濾后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL濾液，加入5mL水混勻后做待凈化液。
2.奶酪、奶油和巧克力等：
稱取2g（至0.01g）試樣于研缽中，加入適量海砂（試樣質(zhì)量的4倍～6倍）研磨成干粉狀，轉(zhuǎn)移至50mL具塞塑料離心管中，用15mL三氯乙酸溶液分?jǐn)?shù)次清洗研缽，清洗液轉(zhuǎn)入離心管中，再往離心管中加入5mL乙腈，余下操作同1.中“超聲提取10min，……加入5mL水混勻后做待凈化液”。
注：若樣品中脂肪含量較高，可以用三氯乙酸溶液飽和的正己烷液液分配除脂后再用SPE柱凈化。
2、凈化
將1中的待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱（m）中。依次用3mL水和3mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液（i）洗脫。整個(gè)固相萃取過(guò)程流速不超過(guò)1mL/min。洗脫液于50℃下用氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑铮ㄏ喈?dāng)于0.4g樣品）用1mL流動(dòng)相定容，渦旋混合1min，過(guò)微孔膜（q）后，供HPLC測(cè)定。
五、液相色譜測(cè)定
5.1HPLC參考條件
a)色譜柱：C8柱，250mm×4.6mm（i.d.），5μm，或相當(dāng)者；C18柱，250mm×4.6mm（i.d.），5μm，或相當(dāng)者。
b)流動(dòng)相：C8柱，離子對(duì)試劑緩沖液（j）-乙腈（85+15，體積比），混勻C18柱，離子對(duì)試劑緩沖液（j）-乙腈（90+10，體積比），混勻。
c)流速：1.0mL/min。
d)柱溫：40℃。
e)波長(zhǎng)：240nm。
f)進(jìn)樣量：20μL。
5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
用流動(dòng)相將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到的濃度為0.8、2、20、40、80μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度由低到高進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程?；|(zhì)匹配加標(biāo)三聚氰胺的樣品HPLC色譜圖如下。
5.3定量測(cè)定
待測(cè)樣液中三聚氰胺的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過(guò)線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)樣分析。
5.4結(jié)果計(jì)算
試樣中三聚氰胺的含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按式（1）計(jì)算獲得：
5.5空白實(shí)驗(yàn)
除不稱取樣品外，均按上述測(cè)定條件和步驟進(jìn)行。
5.6方法定量限
本方法的定量限為2mg/kg。
5.7回收率
回收率在添加濃度2mg/kg～10mg/kg濃度范圍內(nèi)，回收率在80%～110%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。
5.8允許差
在重復(fù)性條件下獲得的兩次立測(cè)定結(jié)果的差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。
在線咨詢