安捷倫液相色譜儀HPLC測定石杉堿甲的含量
石杉堿甲是石杉科植物中提取的一種生物堿，是一強(qiáng)效的膽堿酯酶可逆性抑制劑，其作用特點(diǎn)與新斯的明相似，但作用維持時間比后者為長。對真性膽堿酯酶具有選擇性的抑制，抑制強(qiáng)度是假性膽堿酯酶的數(shù)千倍；抑制方式為競爭性和非競爭性的混合型抑制，與單純競爭性抑制劑有顯著不同；易通過血腦屏障進(jìn)入中樞，兼具有中樞及外周治療作用；有效時間長；從胃腸道吸收良好；安全指數(shù)大；穩(wěn)定性好。
由于蕨類植物生長緩慢，繁殖困難，造成了石杉堿甲的原料藥價格昂貴，因此，建立一個石杉堿甲含量的快速檢測方法很有必要。為了科學(xué)、合理地利用石杉屬植物資源，采用HPLC法對石杉中石杉堿甲的含量進(jìn)行測定，為尋找和篩選石杉堿甲新的植物資源提供科學(xué)依據(jù)。
1、儀器與試藥
安捷倫液相色譜儀(帶四元泵，自動進(jìn)樣器，紫外檢測器等);梅特勒天平;KQ50B超聲清洗器;電熱恒溫水浴鍋;石杉堿甲對照品(100243-200401);乙腈(色譜純);二次重蒸水;其他試劑均為分析純。
實(shí)驗(yàn)藥材采至貴州黔東南，由貴州科學(xué)院生物研究所王培善教授鑒定為昆明石杉，標(biāo)本存放于貴陽中醫(yī)學(xué)院民族醫(yī)藥研究所，標(biāo)本憑證(20056)。
昆明石杉
2、方法與結(jié)果（安捷倫液相色譜儀）
2.1色譜條件
ZORBAXSB-C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動相0.02mol·L-1磷酸二氫鉀-乙腈 (92∶8)，檢測波長為310nm，流速1ml·min-1，柱溫25℃，進(jìn)樣量為5μl。在此色譜條件下，樣品中的石杉堿甲與其他峰能達(dá)到基線分離， 其理論塔板數(shù)為4656，對稱因子為0.92。石杉堿甲的保留時間為11.15min，對照品與樣品的色譜圖見圖1。
2.2樣品的制備
精密稱取實(shí)驗(yàn)藥材細(xì)粉2g于500ml的圓底燒瓶中，每次加入200ml石油醚提取3次，棄去濾液。濾渣再用95%的甲醇提取3次，合并濾液并 回收溶劑，加入2%的酒石酸溶解，用氨水調(diào)節(jié)pH值至8.0，再用氯方萃取至Dragendorffors反應(yīng)呈陰性，揮干有機(jī)溶劑，用無水乙醇溶解并定 容至25ml即得。
2.3線性關(guān)系的考察
精密稱取石杉堿甲對照品2.40mg于25ml容量瓶中以無水乙醇溶解并定容，得濃度為0.096mg·ml-1對照品溶液，再分別稀釋成 0.096，0.048，0.024，0.012，0.006，0.003mg·ml-1的對照品供試液，在色譜條件下測定。以進(jìn)樣濃度對峰面積進(jìn)行回 歸，得方程：Y=6776.0151X1.0305，r=0.99995?？芍級A甲在0.015～0.48μg之間與峰面積呈良好線性關(guān)系。
2.4精密度實(shí)驗(yàn)
取石杉堿甲對照溶液，在色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果石杉堿甲峰面積的RSD為0.36%(n=6)。
2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
取供試品溶液，每隔2h測定1次，考察石杉堿甲的含量變化，結(jié)果含量的RSD為0.85%(n=6)，表明供試品在10h內(nèi)穩(wěn)定。
2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
精密稱樣品6份，按“2.2”項(xiàng)的要求制備6份供試液，在色譜條件下分別進(jìn)行測定，結(jié)果Hup-A含量的RSD為0.60%(n=6)。
2.7回收率實(shí)驗(yàn)
精密稱取昆明石杉藥材細(xì)粉6份，每份1g，分別加入對照品供試液(0.003mg·ml-1)100ml，按樣品制備方法和色 譜條件，制備加樣回收供試液進(jìn)行測定，計(jì)算回收率(見表1)。結(jié)果石杉堿甲的平均回收率為99.63%，RSD=0.56%(n=6)。表1石杉堿甲加樣 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(略)
2.8樣品的測定
按“2.2”項(xiàng)的要求精密稱取樣品3份，制備供試液，按色譜條件進(jìn)行測定，重復(fù)3次，取平均值，石杉堿甲在原植物中的平均含量為0.03%。
3、討論（安捷倫液相色譜儀）
我們建立了用HPLC反相柱從石杉總堿中直接測定石杉堿甲的方法，該方法線性與精密度良好，平均回收率為99.89%，平均RSD為0.40%。實(shí)驗(yàn)證明該方法易行、靈敏、準(zhǔn)確、可靠。在生產(chǎn)石杉堿甲的工作中得到了證實(shí)。
安捷倫液相色譜儀測定方法是在其它石杉中石杉堿甲含量測定方法的基礎(chǔ)上，改用ZORBAXSB-C18色譜柱及以0.02mol·L-1磷酸二氫鉀-乙腈(92∶8)為流動相。
從石杉堿甲原植物中提取總生物堿，是一個常規(guī)和穩(wěn)定的方法。通過測定總堿中石杉堿甲的含量，便可以推算出原植物中石杉堿甲的含量。該方法已經(jīng)成為檢定原植物的方法并應(yīng)用于工作中。
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