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液相色譜法分析啤酒花浸膏中的 6 種酸性成分
更新時間:2016-02-19   點擊次數(shù):1945次

本文采用HPLC分析啤酒花浸膏中的葎草酮合葎草酮、加葎草酮、蛇麻酮、合蛇麻酮和加蛇麻酮6種同系化合物,通過優(yōu)化色譜條件,在等度洗脫條件下實現(xiàn)了其中兩對難分離同分異構(gòu)體的基線分離;收集這6種組分并對其進行了紫外(UV)光譜、紅外(IR)光譜和質(zhì)譜(MS)表征。

1實驗部分

11儀器和藥品

P230II高壓恒流泵,UV230II紫外-可見波長檢測器,ZW色譜柱恒溫箱;7725i手動進樣閥(美國Rheodyne ) ;Finnigan   -質(zhì)  聯(lián)  ( Thermo公司) ;TU-1810APC紫外-可見分光光度計;EQUINOX55型傅里葉變換紅外光譜儀(德國BRUKER公司)。

甲醇、乙腈乙醇(色譜純) ;磷酸(分析純) ;實驗用水由Milli-Q純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備;啤酒花浸膏。

12樣品制備

稱取1.0056g浸膏于5mL離心管中,在30°C水浴中超聲振蕩,用30mL甲醇分多次將樣品轉(zhuǎn)移至50mL燒杯中,在水浴中超聲振蕩30min后轉(zhuǎn)移至100mL   中,用    容,充   。19.0mL上述溶液于50mL容量瓶中,用甲醇定容,混勻,用0.45μm油膜過濾,濾液供分析。樣品應(yīng)在避光低溫條件下保存。

13分析條件

HPLC條件:HypersilODS2色譜柱(250mm×4.6mm,5μm) ,流動相為乙腈-0.1%(v/v)磷酸水溶液(pH2.2) (6535,v/v) ,流速為1.0mL/min,檢測波長為315nm,進樣量為20μL,柱溫為室溫。

UV光譜條件:樣品用乙腈溶解,掃描波長范圍為199499nm。IR光譜條件:將樣品與干燥的KBr粉末按1100的質(zhì)量比混合,在瑪瑙研缽中研磨壓片,掃描范圍為4500500cm1

MS條件:電離方式為電噴霧電離(ESI) ,離子源溫度為150.00°C,檢測器電壓為3.05kV,質(zhì)量掃描范圍為m/z300.001000.00,一級全掃描質(zhì)譜分析。

2結(jié)果與討論

21色譜條件的優(yōu)化

211磷酸的影響

以甲醇-(0.26%磷酸或磷酸調(diào)節(jié)pH2.5)為流動相分析啤酒花浸膏中的α-酸和β-酸為參考,考察了酸的加入對HPLC分離啤酒花浸膏中的α-酸和β-酸的影響。從圖2a中可以看出,不加酸時色譜峰展寬,且嚴(yán)重拖尾,分離度低;加入0.1%(v/v)磷酸后目標(biāo)物的出峰時間比不加酸時滯后了34min(見圖2b) ,其原因可能是不加酸時啤酒花浸膏樣品中的有效成分解離,以離子形式存在,在C18柱中保留相對較弱,導(dǎo)致出峰提前;加入酸使流動相的酸度增加,抑制了目標(biāo)物在溶劑中的解離,使目標(biāo)物峰的峰形得到改善,柱效增加,樣品的分離度也明顯提高

212有機溶劑的影響

考察了分別以甲醇、乙醇及乙腈作為流動相中的有機相對啤酒花浸膏的HPLC分離效果。從圖3a可知,以甲醇作有機相時zui大保留時間大于350min,且組分23沒有達(dá)到基線分離;從圖3b可知,以乙醇作有機相時可分出4種組分,分別為合葎草酮(1)、葎草酮與加葎草酮合峰(2+3)、合蛇麻酮(4)蛇麻酮與加蛇麻酮合峰(5+6) ,兩對同分異構(gòu)體都沒有得到很好的分離;從圖3c可知,乙腈的選擇性相對較好,用其作有機相時柱壓較小,且6種組分均得到了較好的分離,兩對同分異構(gòu)體的分離度(Rs)分別為1.581.55,均實現(xiàn)了基線分離,故選擇乙腈作流動相的有機相。

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213溫度的影響

在色譜分離中,色譜柱溫度的改變會影響樣品的分離度及保留時間,故有考察的必要。研究結(jié)果表明,溫度每上升5°C,分離時間縮短約5min(以組分5,兩對同分異構(gòu)體的分離度變化如表1所示。

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柱溫從室溫(25°C)上升到35°C時,組分2356的分離度分別下降12.7%18.7%,分離度均低于1.5,不能達(dá)到基線分離的要求12;溫度上升到45°C時,組分56的分離度下降了約30%。溫度的升高雖然使保留時間提前,但分離度相應(yīng)地降低,使兩對同分異構(gòu)體的分離效果變差,不能達(dá)到基線分離,故選擇柱溫為室溫。

22有效成分的制備與表征

221有效成分的制備

1.2節(jié)中所制備的樣品在*分離條件下進樣,按出峰時間收集6種組分(合葎草酮、葎草酮加葎草酮、合蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮,分別記為I、IIIII、IV、VVI。1.3節(jié)所述的分析條件分別對收集的6個組分進行HPLC分析,檢測其純度。通過面積歸一化法測得6種組分的純度分別為98.2%、94.3%96.6%、93.2%、92.6%90.2%。

222結(jié)構(gòu)表征

(1)UV光譜:組分IUV光譜如圖4所示,其zui大紫外吸收波長max)227nm;從其余5種組分的UV光譜(圖略)可見其λmax分別為222、222、323、321323nm320nm左右有強的UV吸收帶說明結(jié)構(gòu)式中有3個共軛雙鍵,且此處的吸收譜帶說明還有外環(huán)羥基的作用。羥基是助色基團,其與苯環(huán)連接,形成n-π共軛導(dǎo)致其zui大吸收波張紅移至220nm左右有zui大吸收波長;大于270nm處的譜帶是由于結(jié)構(gòu)式中的羰基的紫外吸收所致;222nm、227nm處的吸收主要是由于六元環(huán)上的烯醇式-酮式互變作用引起。

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(2)IR光譜:組分IIR光譜見圖5(其余5種組分的IR光譜圖略)該化合物在3412cm1的吸收譜帶是羥基的伸縮振動吸收峰;29752840cm13個強吸收譜帶,說明分子內(nèi)有甲基、次甲基、   CH對稱與不對稱伸展振動;1467cm1的譜帶說明分子中含有甲基或乙基;1378cm1處的吸收譜帶證實有甲基存在;15251680cm1處的一組譜帶是六元環(huán)共軛體系C=C和鄰 C=O       區(qū);12001000cm1處的吸收帶表示六元環(huán)上的碳?xì)涿鎯?nèi)的彎曲振動,說明環(huán)上有鄰、、對位取代基。該表征結(jié)果與其結(jié)構(gòu)吻合。

(3)LC-MS:組分I的質(zhì)譜圖見圖6,可以看出其準(zhǔn)分子離子峰為m/z348.96;其余5種組分的準(zhǔn)分子      m/z362.92、362.96、400.94、414.94、414.966種組分的分子式分別為C20H28O5、C21H30O5、C21H30O5、C25H36O4、C26H38O4、C26H38O4,MS表征結(jié)果與理論值一致。

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通過UV光譜、IR光譜和MS對收集的6種組分進行表征,結(jié)果與其結(jié)構(gòu)吻合,確認(rèn)所收集的組分I為合葎草酮,II為葎草酮,III為加葎草酮,IV為合蛇麻酮,V為蛇麻酮,VI為加蛇麻酮

3結(jié)語

建立了HPLC同時測定啤酒花浸膏中6種活性組分的方法,在等度洗脫下實現(xiàn)了兩對難分離同分異構(gòu)體的基線分離該法具有簡便、穩(wěn)定、分離度好等優(yōu)點,可用于啤酒花浸膏中酸性成分的分析。

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