1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料
1.1 儀器
RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；UV-752N 紫外分光光度計(jì)；Agilent1260 液相色譜儀；色譜柱：Phenomenex Luna （250 mm×4.6 mm，5 μm）C18柱；AB- 8 型大孔樹(shù)脂；梅特勒電子天平。
1.2 材料
干玫瑰花，平陰產(chǎn)豐花；原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)> 95%）；甲醇（一級(jí)色譜純）；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水；其余化學(xué)試劑均為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
色譜柱：Phenomenex Luna（250mm×4.6 mm，5μm）C18柱；流動(dòng)相：2%冰醋酸水溶液- 甲醇，梯度洗脫，洗脫時(shí)間程序見(jiàn)表1；進(jìn)樣量：20 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：1 ml·min-1；柱溫：30 ℃。色譜圖見(jiàn)圖1～2。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 對(duì)照品溶液的制備
精密稱(chēng)取原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品5.14 mg， 置10 ml 的容量瓶中， 加甲醇稀釋至刻度，配制成514 μg·ml-1 的原花青素B2的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再精密吸取1 ml、1.5 ml、2 ml、2.5 ml、3 ml 的原花青素B2的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋到10 ml，配成51.4μg·ml-1、77.1 μg·ml-1、102.8 μg·ml-1、128.5 μg·ml-1、154.2 μg·ml-1 的原花青素B2的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用裝有0.22μm 微孔濾膜的濾器進(jìn)行過(guò)濾，棄去初濾液，即得。
2.2.2 樣品溶液的制備
精密稱(chēng)取1.0 g 玫瑰花粉末， 以60%乙醇作為溶劑， 以40∶1 的液料比， 在30 ℃條件下超聲提取10 min，抽濾，低溫減壓蒸發(fā)濃縮，濃縮液溶于蒸餾水得原花青素B2粗提物。然后在處理好的AB-8 型大孔樹(shù)脂的層析柱（20 cm×1 cm）上樣，上樣量為25 ml，上樣后先用3BV 的蒸餾水洗至洗脫液無(wú)色，再用3BV40%的乙醇洗脫，洗脫速度為1 ml·min-1，收集洗脫液，將洗脫液低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，將洗脫液蒸干后用甲醇稀釋溶解定容到10 ml， 制成經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附純化后的玫瑰花原花青素B2的提取物。用裝有0.22 μm 微孔濾膜的濾器進(jìn)行過(guò)濾，棄去初濾液，備用。
2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍
取上述標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各20 μl 進(jìn)樣，測(cè)得峰面積，以原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積（Y）對(duì)于濃度（X）進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=5.3277X+5.9613，R2=0.9998。在51.4～154.2 μg·ml-1 范圍內(nèi)，對(duì)照品濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系，見(jiàn)圖3。
2.2.4 精密度試驗(yàn)
取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液（102.8 μg·ml-1），重復(fù)進(jìn)樣5 次，測(cè)得其峰面積，RSD=0.29%。測(cè)定結(jié)果表明精密度良好。
2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)
取制備好的樣品溶液的續(xù)濾液20 μl 連續(xù)進(jìn)樣5 次，測(cè)得峰面積，RSD=1.47%。測(cè)定結(jié)果表明重復(fù)性良好。
2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取上述對(duì)照品溶液（102.8 μg·ml-1），分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h，測(cè)定1 次，計(jì)算其峰面積的RSD（n=5）為0.49%。結(jié)果表明對(duì)照品在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。
2.2.7 回收率
準(zhǔn)確加入已知濃度原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品2.5 ml，再準(zhǔn)確加入相同濃度的原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品2 ml，甲醇定容至10 ml，用裝有0.22μm 微孔濾膜的濾器進(jìn)行過(guò)濾，棄去初濾液，取20 μl 續(xù)濾液以備進(jìn)樣，測(cè)得峰面積，代入回歸方程，求得相對(duì)應(yīng)的原花青素B2的濃度。結(jié)果平均回收率為98.35%，RSD=1.24%（n=5） 。
2.2.8 樣品含量測(cè)定
各樣品按2.2.2 項(xiàng)下制備成供試液，按2.1 色譜條件下測(cè)定其峰面積，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中原花青素B2的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。
3 討論
本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用HPLC 法對(duì)玫瑰花原花青素提取物進(jìn)行了定性定量分析。結(jié)果顯示：玫瑰花原花青素提取物中存在原花青素B2，且分析了山東產(chǎn)地的11個(gè)品種的玫瑰花含量，其中豐花的含量zui高，紫枝的含量zui低。結(jié)果為：標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=5.3277X+5.9613，R2=0.9998，在標(biāo)準(zhǔn)品濃度為51.4～154.2 μg·ml-1 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。回收率為98.35%（n=5）。zui低檢出限為3.212 μg·ml-1，結(jié)果顯示該方法適合用于分析玫瑰花原花青素提取物。為今后考察各產(chǎn)地和全國(guó)范圍內(nèi)的玫瑰花原花青素B2的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考資料。
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