1 實驗部分
1. 1 儀器與試劑
Waters 液相色譜儀- UV 481 檢測器, N2000 色譜工作站; 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀; UV三用紫外分析儀 。精制大豆磷脂 ; 銀杏提取物, 其中銀杏總黃酮含量不少于24% , 銀杏內(nèi)酯含量大于6% , 銀杏酸含量小于10 - 6( w) ; 槲皮素、山柰素、異鼠李素、白果內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B 標準品(供含量測定用) 均購于中國藥品生物制品檢定所; 甲醇、二氯甲烷、四氫呋喃、乙醇等試劑均為分析純, 實驗用水均為二次蒸餾水。
1. 2 銀杏磷脂復(fù)合物制備
將一定量的銀杏提取物與磷脂在一定條件下反應(yīng)后, 減壓除去反應(yīng)溶劑; 然后再加入適量二氯甲烷, 充分溶解其中的磷脂及復(fù)合物; 過濾, 收集濾液, 減壓蒸餾將二氯甲烷蒸干, 收集固體, 為黃褐色粉末。用以下方法測定黃酮的復(fù)合率。
1. 3 銀杏磷脂復(fù)合物中黃酮復(fù)合率的測定
1. 3. 1 色譜條件
依據(jù)2000 版藥典一部 銀杏葉下黃酮含量測定的方法。Waters C18 柱(300mm×4. 5mm, 4. 5μm) ; 流動相: 甲醇- 0. 5 %磷酸水溶液(體積比50 ∶50) ; 流速1. 0 mL/ min ; 檢測波長365 nm;進樣量為10μL。
1. 3. 2 標準溶液的制備
精密稱取在110 ℃干燥2 h 的槲皮素6. 0 mg , 山柰素3. 4 mg , 異鼠李素2. 1mg , 置同一50 mL 容量瓶中, 用甲醇溶解并稀釋至刻度, 作為對照品溶液。
1. 3. 3 銀杏葉提取物樣品溶液的制備
精密稱取銀杏葉提取物50 mg , 加甲醇- 25%鹽酸(體積比4 ∶1)混合液5 mL , 回流30 min , 放冷, 轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中,加甲醇至刻度, 搖勻即得。
1. 3. 4 銀杏磷脂復(fù)合物樣品溶液的制備
稱取75 mg 的復(fù)合物, 同上法制備樣品溶液。
1. 3. 5 產(chǎn)品中黃酮復(fù)合率的測定
測得銀杏磷脂復(fù)合物中總黃酮醇苷的質(zhì)量分數(shù)( w) , 按下式計算黃酮復(fù)合率: 
式中w 表示質(zhì)量分數(shù)(下同) , 總黃酮醇苷質(zhì)量分數(shù)由下式得到:
w(總黃酮醇苷) = [ w(槲皮素) + w(山柰素) + w(異鼠李素) ] ×2. 51
2 結(jié)果與討論
2. 1 分析方法的選擇
如用紫外分光光度法測量銀杏中黃酮成分時加入AlCl3 等作為顯色劑, 但磷脂也與顯色劑作用, 在銀杏黃酮的zui大吸收波長360 nm處也有強吸收, 引起干擾。用藥典所載HPLC方法, 復(fù)合物在酸性條件下水解, 磷脂陰性對照在360 nm處沒有吸收, 無干擾, 因而可依該法測定復(fù)合物中銀杏總黃酮醇苷的含量, 見圖1。
2. 2 標準曲線的繪制
分別精密吸取標準溶液3、5、6、8、10、15、20μL , 按照上述色譜條件進樣分析。槲皮素( Y1) 、山柰素(Y2) 、異鼠李素( Y3) 的含量(mg/ mL) 與峰面積( X1、X2、X3) 的線性回歸方程為Y1 = 1. 383 ×10 - 7 X1 + 0. 037 , r1 = 0. 999 7 ;Y2 = 1. 264 ×10 - 7 X2 + 0. 029 , r2 = 0. 999 5 ; Y3 =1. 377 ×10 - 7 X3 + 0. 017 , r3 = 0. 999 6。
2. 3 回收率及精密度測定
精密稱取5 份已知總黃酮醇苷含量的銀杏磷脂復(fù)合物, 每份60 mg 分別加入槲皮素4 mg、山柰素2 mg、異鼠李素1 mg , 按1. 3. 4 方法制備樣品,測得總黃酮醇苷的加樣回收率為96% , RSD 為1. 9 %。取銀杏磷脂復(fù)合物的樣品5 份, 每份約80 mg , 精密稱定, 分別按方法制得供試品溶液, 測定總黃酮醇苷含量的RSD 為2. 1 %( n = 5) 。
2. 4 穩(wěn)定性試驗
取槲皮素0. 08 mg/ mL、山柰素0. 04 mg/ mL、異鼠李素0. 02 mg/ mL 的對照品溶液在配制的當天以及后兩天的不同時間進樣測定, 測得總黃酮醇苷含量的RSD 為2. 8% , 表明對照品至少在3 d 內(nèi)穩(wěn)定。
2. 5 陰性對照實驗
精密稱取銀杏葉提取物的陰性樣品90 mg , 按照方法1. 3. 4 制得陰性對照液, 進樣測定, 在3 個對照品出峰的位置不出現(xiàn)干擾測定的色譜峰。
2. 6 復(fù)合物制備方法的優(yōu)化
以表1 的3 因素3 個水平進行正交設(shè)計試驗, 做L9(34) 表, 以1. 3. 5 中黃酮復(fù)合率為評價指標。根據(jù)極差分析得到, RB > RA > RC , 影響因素大小順序為B > A > C。其中溶劑因素是影響黃酮轉(zhuǎn)換率的重要因素, 銀杏磷脂復(fù)合物*制備條件為A3B2C3 , 即銀杏與磷脂的配比為1 ∶2 , 四氫呋喃為溶劑, 反應(yīng)時間為20 h。從試驗結(jié)果可以看到, 以介電常數(shù)較小的四氫呋喃和二氯甲烷- 甲醇(體積比6 ∶1) 為反應(yīng)溶劑時, 復(fù)合率較高。而以介電常數(shù)較大的甲醇為反應(yīng)溶劑時藥物的復(fù)合率較低, 是因為在非質(zhì)子溶劑中進行反應(yīng), 有利于反應(yīng)物間的相互作用。隨磷脂的比例提高, 復(fù)合率呈增長趨勢。主要因為磷脂對藥物可能具有一定的增溶作用 , 且兩類物質(zhì)之間的鍵合作用有一定的配比度, 2 ∶1 的比例有利于二者充分地相互作用。
2. 7 復(fù)合物中銀杏內(nèi)酯的檢查
銀杏內(nèi)酯是銀杏提取物中重要的活性成分,對銀杏磷脂復(fù)合物的藥用活性有重要的決定意義。 取質(zhì)量比為1 ∶2 ∶3 的銀杏提取物、磷脂陰性對照和銀杏磷脂復(fù)合物進行薄層層析, 結(jié)果如圖2?？梢娫趶?fù)合物中依然有白果內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯A、B 的存在, 磷脂無干擾。雖沒有購得銀杏內(nèi)酯C 的標準品, 但與文獻[ 15]圖譜比較, 也可推知有銀杏內(nèi)酯C的存在。
2. 8 復(fù)合率的測定
經(jīng)1. 3. 3 測試銀杏葉提取物的總黃酮含量為25. 40 %( n = 3) 。在*工藝條件下, 重復(fù)3 次實驗, 黃酮復(fù)合率均高于98%。復(fù)合物中黃酮醇苷含量可達8. 30 %。
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