為了保證分析檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，必須對所采用的分析方法的準(zhǔn)確性、科學(xué)性和可行性進(jìn)行驗證，以證明分析方法符合檢測的目的和要求，這就是分析方法驗證。從本質(zhì)上講，方法驗證就是根據(jù)檢測項目的要求，預(yù)先設(shè)置一定的驗證內(nèi)容，并通過設(shè)計合理的試驗來驗證所采用的分析方法符合檢測項目的要求。方法驗證在質(zhì)量控制上有重要的作用和意義，只有經(jīng)過驗證的分析方法才能用于藥品生產(chǎn)的分析檢測，方法驗證是制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。方法驗證內(nèi)容包括方法的專屬性、線性、范圍、準(zhǔn)確度、精密度、檢出限、定量限、耐用性和系統(tǒng)適用性等，檢測目的不同驗證要求也不盡相同。
1.專屬性
專屬性是指分析方法能夠?qū)a(chǎn)品和雜質(zhì)分開的特性，也稱為選擇性。對于純度檢測，可在標(biāo)準(zhǔn)品中加入產(chǎn)品中的已知雜質(zhì)，或者直接用粗品，考察產(chǎn)品峰是否受到雜質(zhì)的干擾，對于過程跟蹤，可用反應(yīng)體系樣品來考察有沒有其它的雜質(zhì)干擾。必要時使用二極管陣列檢測器或者質(zhì)譜檢測器進(jìn)行色譜峰純度檢查。一般要求產(chǎn)品和雜質(zhì)之間的分離度大于2.0。
2.線性
線性是在設(shè)定的范圍內(nèi)，檢測結(jié)果與樣品中原料或產(chǎn)品的濃度呈線性關(guān)系的程度。線性是定量檢測的基礎(chǔ)，需要定量檢測的項目都需要驗證線性。一般用貯備液經(jīng)過精密稀釋，或分別精密稱樣，制備得到一系列被測物質(zhì)的濃度（5個以上），按濃度從小到大運(yùn)行序列，以峰面積和濃度的函數(shù)作圖，用zui小二乘法進(jìn)行線性回歸計算，考察分析方法的線性。
3.范圍
范圍指在能夠達(dá)到一定的準(zhǔn)確度、精密度和線性時，樣品中被分析物的濃度區(qū)間。簡單的說，范圍就是分析方法適用的樣品中待測物的濃度zui大值和zui小值。需要定量檢測的分析方法都需要對范圍進(jìn)行驗證，純度檢測時，范圍應(yīng)為測試濃度的80％～120％。
4.準(zhǔn)確度
準(zhǔn)確度是指測定的結(jié)果與真實(shí)值之間接近的程度，所以也叫做真實(shí)度，需要定量得分析方法均需要驗證準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)建立，對于原料藥可用已知純度的標(biāo)準(zhǔn)品或符合要求的原料藥進(jìn)行測定，必要時可與另一個已建立準(zhǔn)確度的方法比較結(jié)果。
5.精密度
精密度是指在規(guī)定條件下，同一均勻樣品經(jīng)多次取樣進(jìn)行一系列檢測所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，取樣檢測次數(shù)應(yīng)至少6次。
精密度可以從三個層次考察：重復(fù)性、中間精密度、重現(xiàn)性。
a、重復(fù)性是在相同的操作條件下、較短時間間隔內(nèi)，由同一分析人員測定所得結(jié)果的精密度。一般是用100％濃度水平的樣品測定6次的結(jié)果進(jìn)行評價。
b、中間精密度：同一實(shí)驗室，在日期、分析人員、儀器等內(nèi)部條件改變時，測定結(jié)果的精密度。
c、重現(xiàn)性：指不同實(shí)驗室之間不同分析人員測定結(jié)果的精密度。
6.檢出限
檢出限是指樣品中的被分析物能夠被檢測到的zui低量，不需要準(zhǔn)確定量。檢出限體現(xiàn)了分析方法的靈敏度。檢出限的測定可以通過對一系列已知濃度被測物的試樣進(jìn)行檢測，以能準(zhǔn)確、可靠檢出被測物的zui小濃度來確定，也可把已知濃度樣品的信號與噪聲信號進(jìn)行比較，以信噪比為3：1時的濃度確定檢出限，一般要求能夠達(dá)到進(jìn)樣濃度的0.05%。
7.定量限
定量限是指樣品中的被分析物能夠被定量檢測的zui低量，其測定結(jié)果需要一定的準(zhǔn)確度和精密度，定量限體現(xiàn)了分析方法靈敏定量檢測的能力。檢測需要嚴(yán)格控制含量的雜質(zhì)，必須考察方法的定量限，以保證雜質(zhì)能夠被準(zhǔn)確定量。一般以信噪比為10：1時相應(yīng)的濃度或進(jìn)樣量來確定定量限。
8.耐用性
耐用性是指測定條件發(fā)生小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，耐用性主要表明方法的抗干擾能力，主要的變動因素包括：流動相的組成、流速和pH值、色譜柱、柱溫等。經(jīng)試驗，應(yīng)說明小的變動能否符合系統(tǒng)適用性試驗要求，以確保方法有效。
9.系統(tǒng)適用性試驗
液相色譜分析方法主要依賴液相色譜儀和色譜柱，在做方法驗證時，有必要將液相色譜儀、色譜柱、流動相與實(shí)驗操作、待測樣品等一起當(dāng)作完整的系統(tǒng)進(jìn)行評估，并將系統(tǒng)適用性作為分析方法的組成部分，系統(tǒng)適用性便是對整個系統(tǒng)進(jìn)行評估的指標(biāo)。一般系統(tǒng)適應(yīng)性的要求為：分析方法能夠達(dá)到0.05%的檢出限，主峰的拖尾因子0.5<Tf<2.5，主峰與雜質(zhì)的分離度大于2.0，空白干凈，主峰處無系統(tǒng)峰干擾。
分析方法開發(fā)與驗證是一個整體，在實(shí)際工作中，一般是先開發(fā)分析方法，經(jīng)過適當(dāng)?shù)膬?yōu)化以后再做方法驗證，驗證的部分內(nèi)容在分析方法開發(fā)時就要做，比如說分析方法的專屬性驗證。分析方法驗證并非必須驗證所有的內(nèi)容，只要注意驗證內(nèi)容充分，足以證明分析方法的合理性就可以了，如雜質(zhì)限度檢測一般只需要驗證專屬性和檢出限，而精密度、線性、定量限等涉及定量測定的項目，則不需要驗證。
有時需要對分析方法進(jìn)行全面或部分的再驗證。當(dāng)原料藥合成工藝發(fā)生改變時，可能引入新的雜質(zhì)，雜質(zhì)檢查方法和含量測定方法的專屬性就需要再進(jìn)行驗證，以證明有關(guān)物質(zhì)檢查方法能夠檢測新引入的雜質(zhì)，且新引入的雜質(zhì)對主成份的含量測定應(yīng)無干擾。當(dāng)分析方法發(fā)生部分改變時，如檢測波長發(fā)生改變，則需要重新進(jìn)行檢測限、專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性等內(nèi)容的驗證，以證明改變后的分析方法的合理性、可行性。
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